Діаграма яблунського пояснення з прикладу пі зв'язків. Флуоресцентні репортери та їх репортажі

Люмінесценція - світіння атомів, іонів, молекул, що виникає в результаті електронного переходу в цих частках при їх поверненні зі збудженого стану до нормального. Таким чином молекула перетворює поглинену енергію у власне випромінювання (В. Л. Льовшин). Люмінесценцію називають холодним світінням.

Класифікація видів люмінесценції 1. За тривалістю свічення 2. За способом збудження 3. За механізмом свічення: свічення дискретних центрів – поглинаючими та випромінюючими центрами є одні й ті ж частинки (атоми, молекули, іони) рекомбінаційне свічення – процеси поглинання та у просторі; у процесі збудження відбувається поділ частинки речовини на дві протилежно заряджені частини; подальша їх рекомбінація супроводжується виділенням енергії А + hv A + + e A + + e A * A * A + hv 3

Класифікація люмінесценції за тривалістю світіння флуоресценція (~10 -8 c) При флуоресценції молекула переходить в основний стан з короткоживучого збудженого стану Вона спостерігається відразу ж після поглинання світла, швидко спадає і зникає в результаті зіткнень випромінюючої молекули з іншими молекулами в розчині фосфоресценція (>10 -6 с) Фосфоресценція спостерігається при переході молекули в основний стан відносно довгоживучого збудженого стану, так що між поглинанням і випромінюванням світла може пройти відносно багато часу Для фосфоресценції характерні більша довжина хвилі випромінювання, менша інтенсивність і більший вплив матриці 4 10 -6 с) Фосфоресценція спостерігається при переході молекули в основний стан відносно довгоживучого збудженого стану, так що між поглинанням і випромінюванням світла може пройти відносно багато часу Для фосфоресценції характерні більша довжина хвилі випромінювання, менша інтенсивність і більший вплив матриці 4">

Класифікація люмінесценції за способами збудження Електромагнітне випромінювання УФ- і видимого діапазону Фотолюмінесценція Потік електронів (катодні промені) тразвукСонолюмінесценція Механічне впливТриболюмінесценція Енергія хімічної реакціїХемілюмінесценція 5

В аналітичній практиці частіше використовують фото- та хемілюмінесценцію Флуоресцентні вимірювання більш вибіркові, ніж спектрофотометричні, оскільки залежать від двох довжин хвиль: поглинається і випромінюваного світла У порівнянні з молекулярною абсорбційною спектроскопією метод має більшу чутливість. вихідний сигнал збільшується зі збільшенням інтенсивності випромінювання Межі виявлення для більшості сполук складають ~мкг/мл, що на 1-2 порядки нижче, ніж в абсорбційній спектроскопії 6

Крім того, у ряді випадків спостерігається великий діапазон визначених змістів - іноді до 4-х порядків величин концентрацій - при тій же відтворюваності результатів аналізу, що і в молекулярної спектроскопії абсорбційної Все це зумовило розвиток люмінесцентного методу аналізу 7

Молекулярна люмінесцентна спектроскопія (флуориметрія) Фотопроцеси в молекулах Електронне збудження молекули пов'язане з переходом електрона з основного стану в збуджене з більшою енергією Збуджені молекули переходять в основний стан, часто випромінюючи світло енергії дещо затримується В кінцевому рахунку все ж таки відбувається швидкий перехід всіх збуджених станів в основний стан системи Походження люмінесцентного випромінювання пояснюється діаграмою Яблонського 8

Розглянемо процес збудження валентних електронів молекули На кожен електронний рівень або енергетичний стан (жирні лінії на схемі) накладаються коливальні підрівні з квантовими числами 0,1,2,3 і т. д. При поглинанні кванта світла електрон переходить з основного рівня на вищий. Розрізняють синглетний збуджений стан (усі спини електронів антипаралельні, неспарені електрони відсутні) та триплетний (паралельні спини) Основний стан не може бути триплетним (за принципом Паулі два електрони не можуть мати повний набір однакових квантових чисел) 10

Механізми повернення молекули зі збудженого стану в основний

При кімнатній температурі молекули зазвичай знаходяться в основному стані S 0, і майже всі переходи при поглинанні світла відбуваються з нижнього (основного) коливального підрівня на коливальні підрівні збудженого синглетного стану S 1 або S 2 Час життя електрона в збудженому синглетному стані молекула за рахунок так званої коливальної релаксації при зіткненні з навколишніми молекулами дуже швидко, за час менше, втрачає надмірну коливальну енергію і переходить на основний коливальний рівень збудженого синглетного стану (перехід позначений хвилястими стрілками) 13

Таким же швидким є процес внутрішньої конверсії у вищих електронно-збуджених станах Це безвипромінювальний перехід між коливальними рівнями різних електронних станів, що мають однакову енергію (горизонтальна хвиляста лінія) переходом S 1 S 0 Флуоресценція - процес випромінювального переходу з нижчого збудженого синглетного стану в основний (S 1 S 0) Час згасання флуоресценції з Флуоресценція протікає в одну стадію 14

Енергія фотона, що випускається, нижче, ніж енергія поглиненого фотона, тому спектр флуоресценції молекули знаходиться в області довших хвиль в порівнянні зі спектром поглинання - закон Стокса - Ломмеля h люм

Нагадаємо, що крім синглетного можливий триплетний збуджений стан (паралельні спини електронів) Прямий перехід з основного стану в збуджений триплетний внаслідок поглинання фотона практично неможливий безвипромінювальний перехід, позначений хвилястою стрілкою) Час життя електрона у збудженому триплетному стані – не менше ніж У триплетному стані так само, як і в синглетному відбувається коливальна релаксація, і електрон переходить на нижній коливальний рівень Т 1 20

Безвипромінювальна дезактивація Т 1 S 0 конкурує з випромінювальним Т 1 S 0 переходом Фосфоресценція – випромінювальний перехід між станами різної мультиплетності Хоча такі переходи теоретично заборонені, вони мають місце, хоч і менш ймовірні, ніж S S та ТТ переходи Це відбувається внаслідок спин - орбітальної взаємодії, пов'язаного з рухом ядер, тому зі збільшенням маси ядра спин - орбітальна взаємодія різко зростає (~Z 4) Т. о. ефективність фосфоресценції зростає при введенні в молекулу люмінофора (або розчинника) атомів з великими атомними номерами, наприклад, йоду або брому - ефект важкого атома 21

У розчинах це відбувається при зіткненні з молекулами кисню, що мають неспарені електрони Для спостереження фосфоресценції з розчинів видаляють кисень, більш ефективно заморожування розчинів, або закріплення2

За участю Т 1 - стану може здійснюватися ще один випромінювальний процес - уповільнена флуоресценція, що відбувається в результаті термічної активації молекул Т 1 S 1 і подальшим випромінюванням з нього. Умови прояву уповільненої флуоресценції досить специфічні. Цей тип молекулярної люмінесценції спостерігається в вельми обмежених діапазонах температур, в'язкостей і концентрацій розчинів. збігається зі спектром швидкої флуоресценції, проте час життя уповільненої флуоресценції дорівнює часу життя фосфоресценції 25

Спектр збудження люмінесценції - залежності інтенсивності люмінесценції I від частоти (хвильового числа) або довжини хвилі збуджуючого світла Спектр люмінесценції - залежність інтенсивності люмінесценції від її довжини хвилі I = f(λ); I = f(v) Час життя люмінесценції – час, за який інтенсивність випромінювання зменшиться в раз, оскільки згасання люмінесценції відбувається за законом: I t = I 0 e -t/ τ 27

Для збудження люмінесценції використовується УФ-випромінювання. Джерела випромінювання – газорозрядні лампи, найчастіше ртутно-кварцові та ксенонові Вимірювання люмінесцентного випромінювання найчастіше проводять під прямим кутом до падаючого променя світла, тому кювети повинні бути прозорі у всіх напрямках. служити очей людини. У сучасних приладах використовуються фотопомножувачі Для реєстрації фосфоресценції необхідний пристрій для охолодження проби та механічний або електронний переривник, що дозволяє опромінювати пробу короткими імпульсами і тим самим відокремлювати тривалу фосфоресценцію від короткочасної флуоресценції 31

C пектрофлуориметр фірми Horiba Fluoromax

В основі кількісного аналізу лежить залежність інтенсивності люмінесценції від концентрації люмінесцентної речовини де К - коефіцієнт пропорційності В кв - квантовий вихід люмінесценції I 0 - інтенсивність збуджуючого світла ε - молярний коефіцієнт поглинання l - товщина шару розчину Це співвідношення справедливо, якщо постійні: світла 34

10 -4 М лінійність графіка порушується з - за концентраційного гасіння люмінесценції, самопоглинання та ін. концентраціях >10 -4 М лінійність графіка порушується через концентраційне гасіння люмінесценції, самопоглинання та ін. Залежність інтенсивності флуоресценції" class="link_thumb"> 35 !}Залежність лінійна в межах 3-4 порядків величин концентрації (М) При концентраціях >10 -4 М лінійність графіка порушується через концентраційне гасіння люмінесценції, самопоглинання та ін. Залежність інтенсивності флуоресценції від концентрації флуоресцентної речовини 35 10 -4 М лінійність графіка порушується через - за концентраційного гасіння люмінесценції, самопоглинання ф3 > 10 -4 М лінійність графіка порушується через - за концентраційного гасіння люмінесценції, самопоглинання та інших. При концентраціях >10 -4 М лінійність графіка порушується через концентраційне гасіння люмінесценції, самопоглинання та ін. Залежність інтенсивності флуоресценції"> title="Залежність лінійна в межах 3-4 порядків величин концентрації (10 -7 -10 -4 М) При концентраціях >10 -4 М лінійність графіка порушується через концентраційне гасіння люмінесценції, самопоглинання та ін. Залежність інтенсивності флуоресценції"> !}

Гасіння люмінесценції відбувається при зіткненні збудженої молекули з іншими, особливо парамагнітними (розчинений кисень), які стимулюють процеси інтеркомбінаційної конверсії. Підвищення температури зменшує вихід люмінесценції. Це з тим, що зростає частота зіткнень, у яких відбувається безвипромінювальна дезактивація збуджених молекул. Тому визначення проводяться, як правило, при кімнатній температурі. Присутність сторонніх речовин також знижує вихід люмінесценції. Найбільш активні гасителі люмінесценції - катіони та аніони «важких» елементів (I -, Br -, Cs + та ін), парамагнітні іони та молекули (Mn 2+, O 2 та ін), молекули розчинника Самопоглинання - полягає в поглинанні частини випромінюваного світла шаром люмінесцентної речовини 36

Застосування методу 37 Кількість флуоресціюючих речовин обмежена. Метод застосовний для визначення речовин, що володіють власною люмінесценцією (сполуки U(VI), особливо ураніл - іона UO 2 +, РЗЕ та ін) іонів металів у вигляді комплексів з органічними реагентами: 8- оксихінолін та його похідні (понад 25 елементів, т. ч. Li, Ca, Mg, Ba, Sc, Al, In, Ga) оксиазо- та оксиазометинові сполуки (Al, Ga, Mg та ін) поліоксифлавони (Zr, Hf, Sn, Th, Al, Be) родамінові барвники (Au, In, Ga, Hg, B, Te та ін.) органічних речовин - конденсованих поліароматичних систем (антрацен, флуорен, флуоресцеїн)

38 кристалофосфорів або твердих розчинів. Зазвичай їх отримують спіканням основної речовини (ZnS, CdS, CaS, SrS та ін) з активатором (сполуки Ag, Cu, Mn, Ce та ін) і плавнем (NaCl, NaNO 3, K З l, CaF 2 та ін. ). У деяких випадках кристалофосфор вдається отримати сокристалізацією активатора та основної речовини з насиченого розчину останнього. Спектр люмінесценції кристалофосфору визначається типом активатора Кристалофосфори позначають хімічними символами основної речовини, що утворює кристалічну структуру активатора і плавня. Наприклад, запис ZnS × Ag × NaCl означає, що даний кристалофосфор являє собою сульфід цинку, активований атомами срібла, і при синтезі його використаний плавінь хлорид натрію

Наприклад, уран у кількості 10 -5 мкг можна визначити із застосуванням кристалофосфору на основі NaF, сурму в кількості 10 -6 мкг - на основі CaO, рідкісноземельні елементи в кількості 10 -6 мкг - на основі ThO 2 Чутливість визначення порівнянна, а іноді і перевершує атомно-спектроскопічні методи: селективність не дуже висока 39

Визначення органічних сполук засноване на а) прямих методах по флуо- і фосфоресценції; б) ефекті Шпільського; в) фосфоресценції при кімнатній температурі. цьому молекули ізольовані один від одного і жорстко закріплені в розчиннику, внаслідок чого спектри являють собою серію вузьких спектральних ліній і мають яскраво виражену індивідуальність.

Фосфоресценція органічних молекул зумовлена дезактивацією збуджених триплетних станів. Час життя триплетних станів настільки велике (до 100 с), що з спостереження фосфоресценції необхідно зафіксувати молекулу в триплетном стані в жорстку матрицю, т. е. іммобілізувати. Для отримання спектрів фосфоресценції застосовують органічні розчинники, що кристалізуються при низьких температурах найчастіше використовують суміші: етиловий спирт - диметилформамід; етиловий спирт - ізопентан - діетиловий ефір, які кристалізуються в склоподібну масу при температурі кипіння рідкого азоту 77 К 44

45 Для вимірювання фосфоресценції при кімнатній температурі люмінофор закріплюють на сорбенті, обробленому солями Ag, Tl, Hg, бромідами, іодидами та ін. (ефект важкого атома) Сорбенти – фільтрувальний папір, оксиди кремнію того, підвищується селективність, тому що ефект важкого атома дуже специфічний

Якісний аналіз 46 Спектр люмінесценції є індивідуальною характеристикою люмінесцентної речовини. Спектри можуть використовуватися для якісного люмінесцентного аналізу. Зазвичай такий аналіз проводиться візуально за кольором випромінювання. Якісний люмінесцентний аналіз застосовують для дослідження мінералів, визначення марок стекол, сортів мастил і т. п. Дуже чутливі якісні люмінесцентні реакції, що використовуються для виявлення іонів. люмінесценція літію з 8-оксихіноліном виникає в присутності 0,1 мкг/мл Li, мідь відкривають по яскраво синій люмінесценції її сполуки з саліцилалазином при концентрації 0,05 мкг/мл і т.д.

Хемілюмінесцентний аналіз 47 Хемілюмінесцентне випромінювання спостерігається тоді, коли в ході хімічної реакції утворюється збуджена молекула, здатна люмінесцувати при переході в основний стан. збуджений стан і потім випустить квант світла (непряма або сенсибілізована хемілюмінесценція) Для збудження хемілюмінесценції у видимій області спектра потрібна енергія 160 кДж/моль. Це характерно для радикальних, ланцюгових та окислювально-відновних реакцій, що протікають за вільно-радикальним механізмом.

48 На практиці найчастіше використовують реакції окиснення ряду органічних речовин, таких, як люмінол (V), лофін (VI), люцигенін (VII) та ін. інгібувати хемілюмінесцентну реакцію Зміна інтенсивності при цьому пропорційно концентрації елементів Для виконання аналізу потрібно лише виміряти інтенсивність люмінесцентного випромінювання, що виникає, за допомогою фотопомножувача Оскільки єдиним джерелом випромінювання є хімічна реакція, розкладання світла в спектр не потрібно, т. е. не вимагаються

49 Метод хемілюмінесценції використовується визначення неорганічних і органічних речовин з межею виявлення до 10 –8 %. Розроблено методики визначення платинових металів, Fe, Co, Ni, Cu, Cr та ін. з ПЗ до мкг/мл, але ці методики не мають високої селективності. . Реакції NO + O 2 NO 2 * + O 2 NO 2 * NO 2 + hv супроводжуються люмінесценцією з максимумом при 800 нм Чутливість визначення озону з барвником родаміном становить до % (1 ppb)

Атомно - флуоресцентна спектроскопія 50 Атомно - флуоресцентний аналіз метод елементного аналізу за спектрами атомної флуоресценції Аналізований зразок атомізують, атомний пар, що утворився, для збудження флуоресценції опромінюють потоком світла. Випускається збудженими атомами флуоресценцію (як правило, резонансну) реєструють Якщо потік світла містить кванти з енергією, що відповідає збудженню першого рівня, атом, що опромінюється, перейде в збуджений стан, а потім при поверненні буде випускати світло з довжиною хвилі, що відповідає резонансному переходу. Цей процес також називають резонансною флуоресценцією

51 Схема збудження флуоресценції: а і б резонансна флуоресценція з різних рівнів; в резонансна та стоксова флуоресценція; г резонансна та антистоксова флуоресценція; д каскадна флуоресценція; е ступінчасте збудження флуоресценції двома квантами (ν 12 + ν 23)

52 Залежно від кількості фотонів, що припадають на один акт збудження, механізм збудження може бути однофотонним або ступінчастим багатофотонним. нерезонансної флуоресценції (в – е) Нерезонансну флуоресценцію називають стоксовою, якщо фотон, що випускається менше поглиненого, і антистоксової, коли фотон, що випускається, більше поглиненого Якщо перехід зі збудженого стану в основне здійснюється шляхом послідовних переходів, кожен з яких супроводжується випусканням фотонів, то такий тип ф каскадною флуоресценцією (д) У реальних атомах число електронних енергетичних рівнів більше трьох. Для заселення будь-якого з них існує ряд можливостей за участю ступінчастих і каскадних переходів при зіткнювальних і випромінювальних процесах. Як правило, кількість ліній у спектрах атомної флуоресценції не перевищує десятка.

53 Для атомізації рідких зразків (розчинів) можна використовувати будь-який спосіб атомізації полум'я, аргонову високочастотну індуктивно - пов'язану плазму або електротермічні атомізатори (нагрівані електричним струмом графітові трубки, нитки, стрижні, тиглі) Атомізацію порошкоподібних проб здійснюють електротермічними іноді вносять у полум'я для додаткового нагріву парів проби атомизатор зазвичай поміщають в атмосферу аргону з метою збільшення виходу

55 Порушення атома відбувається під дією зовнішнього джерела випромінювання Частка збуджених атомів визначається не температурою атомізатора, як в АЕС, а інтенсивністю цього джерела Для вільних атомів величини квантових виходів, як правило, вкрай невеликі через високу температуру середовища, тому в АФС використовують потужні джерела випромінювання збудження флуоресценції використовують інтенсивні лампи з лінійним або безперервним спектром (лампи з порожнистим катодом або безелектродні), а також лазери з довжиною хвилі, що перебудовується Останнім часом метод АФС розвивається виключно в лазерному варіанті - ЛАФС Використання лазерів дозволило різко збільшити чутливість методу

56 Лазери або оптичні квантові генератори – це сучасні джерела когерентного випромінювання Фізичною основою роботи лазера служить явище вимушеного індукованого випромінювання Суть явища полягає в тому, що збуджений атом здатний випромінювати фотон під дією іншого фотона без його поглинання, якщо енергія останнього і після випромінювання При цьому випромінюваний фотон когерентний фотону, що викликав випромінювання (є його "точною копією"); надзвичайно висока ступінь його монохроматичності недосяжна в випромінюванні нелазерних джерел В результаті узгодженого, кооперативного випромінювання світлових квантів багатьма атомами робочої речовини відбувається посилення світла межах від часток милливатта до –10 13 Вт (в імпульсному режимі)

Гелій - неоновий лазер 58 У високовольтному електричному розряді внаслідок зіткнень з електронами значна частина атомів гелію переходить у збуджений стан. починається лавиноподібний процес розмноження ідентичних когерентних фотонів. Якщо кювета з сумішшю газів поміщена між високовідбивними дзеркалами, то виникає лазерна генерація Світиться промінь в центрі це не власне лазерний промінь, а електричний розряд, що породжує світіння, подібно до того, як це відбувається в неонових лампах Промінь проектується на екран праворуч у вигляді червоної крапки, що світиться

59 Аналітичним сигналом служить випромінювання в УФ - частини спектра, що випромінюється збудженими атомами Інтенсивність атомної резонансної флуоресценції в першому наближенні пропорційна концентрації випромінюючих частинок: I 0 - інтенсивність збуджуючого світла кв - квантовий вихід флуорес ценції k - коефіцієнт поглинання

60 Основною перешкодою при атомно - флуоресцентних визначеннях елементів є розсіяне випромінювання, яке виникає внаслідок розсіювання випромінювання від джерела збудження на атомах і молекулах аналізованого зразка Розсіяне випромінювання часто маскує слабкі сигнали резонансної флуоресценції хвилі аналітичної лінії збігаються з довжиною хвилі розсіяного світла Щоб уникнути перешкод, пов'язаних з розсіяним випромінюванням, для вимірювання використовують лінії нерезонансної флуоресценції У цьому випадку ефект збудження досягається лише за допомогою лазерів

61 Для реєстрації спектру флуоресценції застосовують світлосильні спектрофотометри з великим кутом.

69 Лінійчастий характер спектрів атомної флуоресценції забезпечує атомно-флуоресцентному аналізу високу селективність Лінії у спектрі атомної флуоресценції дуже вузькі, і це дає можливість визначати одночасно кілька елементів. Для цього навколо атомізатора встановлюють відповідне число світлосильних спектрофотометрів. Метод АФС легко автоматизується, вартість апаратури відносно невисока. сечі), різних хімічних сполук, для дистанційного визначення елементів у верхніх шарах атмосфери

Порівняння меж виявлення елементів (нг / мл) методами атомної спектроскопії Елемент ААС (полум'я) ААС (е/т) АЕС (полум'я) АЕС (ППТ) АЕС (ІСП) АФС 5 1 0,01 0,04 0,1 8 0,01 0,1 0,01 0,02 0,0002 0,01 2 0,5 0,3 0,2 0,01 0,003 0,1 0,8 0,4 0,6 0,5 0,09 0,9 0,4 0,2 0,001 0,8 70

Порівняння меж виявлення елементів (нг/мл) методами атомної спектроскопії Елемент ААС (полум'я) ААС (е/т) АЕС (полум'я) АЕС (ППТ) АЕС (ІСП) АФС Mg 0,1 0,02 0,02 0,9 0,1 0,8 0,0002 0,0005 0,005 0,02 0,08 0,004 0,05 0,03 0,2 0,007 0,05 0,001 0,2 ,5 2 0,5 45 0,003 0,01 0,04 0,2 2 0,1 0,2 10 1,5 0,1 0,4 0,06 0,1 0,

ГЛАВА 1.

Введення у флуоресценцію

Люмінесценція- випромінювання фотонів з електронно-збуджених станів - ділиться на два типи залежно від природи основного та збудженого станівУ синглетному збудженому стані електрон на енергетично вищій орбіталі і другий електрон на орбіталі з нижчою енергією мають протилежну орієнтацію спинів. Кажуть, що ці електрони спарені*. У триплетном стані ці електрони не спарені, тобто. їхні спини мають однакову орієнтацію. При поверненні електрона із збудженого синглетного стану в основне орієнтація його спина не повинна змінюватися. Зміна орієнтації спина необхідна при переході з триплетного стану в основний синглетний стан. Флуоресценція- це випромінювання, що відбувається при поверненні спареного електрона на нижчу орбіталь. Такі переходи квантовомеханічно "дозволені", а типові величини швидкостей випромінювання для них ~10 8 з -1. Високі значення швидкостей випромінювання призводять до часів згасання флуоресценції ~ 10 -8 с (10 нс). Час життя - це середній період часу, протягом якого флуорофор перебуває у збудженому стані. Фосфоресценція- це випромінювання, що відбувається при переході між станами різної мультиплетності **, як правило, зі збудженого триплетного стану до основного синглетного. Такі переходи не дозволені, і константи швидкості випромінювання малі. Типовий діапазон часу загасання фосфоресценції – від мілісекунд до секунд, що головним чином залежить від внеску інших процесів дезактивації. У цій книзі всюди ми насамперед розглядатимемо швидший процес флуоресценції.

У речовинах, що виявляють значну флуоресценцію, електрони переважно делокализованы і формально розташовані на сполучених подвійних зв'язках.

* Правильніше було б сказати, що спини цих електронів спарено. Спареними зазвичай називають електрони, що знаходяться на одній і тій же орбіталі, - Прим. ред.

** Мультиплетність стану називають величину т = 2s + 1, де s - сумарний електронний спин даного стану. Так, для синглетних станів т = 1 і s = 0, для триплетних - т = 3 та s = 1 - Прим.ред.

Структури деяких типових флуорофор представлені на рис. 1.1. Одним із широко поширених флуорофорів є хінін, який додають у тонізуючі напої. Якщо подивитися на склянку тоніка, виставленої на сонячне світло, часто можна побачити слабке блакитне свічення. Воно найбільш помітно, якщо на склянку дивитися під прямим кутом до напрямку сонячного світла, а також, якщо постійна діелектрична зменшена завдяки присутності добавок. Хінін, що збуджується ультрафіолетовим випромінюванням сонця, при поверненні в основний стан випромінює блакитне світло з довжиною хвилі близько 450 нм. Явище флуоресценції часто може бути зумовлене деякими добавками. Наприклад, зелене або червоно-оранжеве свічення, яке спостерігається іноді в антифризі, ймовірно, викликане слідовими кількостями флуоресцеїну або родаміну відповідно (рис. 1.1). Багатоядерні ароматичні вуглеводні, такі як антрацен або перилен, також флуоресціюють, чим може частково визначатися блакитна флуоресценція бензину. І нарешті, сильно флуоресцируют такі сполуки, як РРО та РОРОР, що використовуються у "сцинтиляційних" розчинах та біохімічних дослідженнях. Інші приклади будуть дано у книзі з посиланнями на корисні властивості індивідуальних флуорофорів. На відміну від молекул органічних ароматичних сполук атоми* переважно не флуоресцируют у конденсованій фазі.

МАЛ. 1.1. Структури типових флуоресціюючих сполук.

МАЛ. 1.2. Спектри поглинання та випромінювання флуоресценції перилену та хініну (за даними).

Спектри випромінювання не можуть бути правильно зображені одночасно в шкалі довжин хвиль та в шкалі хвильових чисел. У цьому випадку використано правильне зображення у шкалі хвильових чисел. Довжини хвиль наведені для зручності (див. гл. 2).

Єдиним помітним винятком є група елементів, які зазвичай називають лантаноїдами [1]. Флуоресценція іонів європейська та тербія викликана переходами електронів між f-орбіталями, які екрановані від розчинника вищими заповненими орбіталями.

Флуоресцентні спектральні дані зазвичай представляють у вигляді спектрів випромінювання. Спектр випромінювання флуоресценції- це залежність інтенсивності флуоресценції від довжин хвиль (нанометрах) чи хвильових чисел (см -1). Два типові спектри випромінювання флуоресценції наведено на рис 1.2. Спектри випромінювання сильно змінюються і залежать як від хімічної структури флуорофору, так і від розчинника, в якому розчинений флуорофор. Спектри деяких сполук, таких як перилен, мають чітку структуру, обумовлену окремими коливальними рівнями енергії основного та збудженого станів. Інші сполуки, такі як хінін, мають спектри без коливальної структури.

*Коливальна структура спектрів випромінювання визначається коливальними підрівнями основного, а не збудженого електронного стану (докладніше см„ нижче). - Прим.. peд,

1.1. Діаграма Яблонської

Поглинання і випромінювання світла добре ілюструє діаграма рівнів енергії, запропонована Яблонським [3], Основний, перший і другий електронні стани позначають S 0 , S, і S 2 відповідно (рис. 1.3). рівнів, що позначаються 0, 1, 2 і т. д. Вплив розчинника до уваги не приймається, воно буде розглянуто докладніше в гол. 7. Переходи між різними електронними рівнями позначені вертикальними лініями. Таке подання використовуєтьсящоб наочно показати миттєву природу поглинання світла. Цей процес відбувається приблизно за 10 -15 с, час занадто короткий для помітного зміщення ядер (принцип Франка - Кондона).

Енергетична щілина між різними коливальними рівнями енергії видно зі спектру випромінювання перилену (див. рис. 1.2). Окремі максимуми випромінювання (а отже, і коливальні рівні енергії) відстоять один від одного приблизно на 1500 см-1. Відносне число молекул перилену, що знаходяться в коливальних станах 0 і 1, описується розподілом Больцмана:

Відношення R числа молекул у двох станах з різницею енергій Е дається виразом

R = e -  E/kT (1.1)

де k – константа Больцмана; Т - абсолютна температура, К. При кімнатній температурі 300 До відношення R дорівнює 0,01. Отже, більшість молекул перебуватиме в нижньому коливальному стані; саме такі молекули і поглинають світло.

МАЛ. 1.3. Діаграма Яблонської.

Через велику різницю енергій між рівнями S 0 і S 1 по суті, у жодних флуорофорів стан S 1 не може бути заселений термічним шляхом. Цікаво відзначити, що навіть мале термічно активоване заселення першого збудженого коливального стану молекул можна зареєструвати, використовуючи відмінність спектрів поглинання за різних температур.

За поглинанням світла зазвичай слідує кілька інших процесів. Порушення флуорофора, зазвичай, відбувається до деякого вищого коливального рівня станів (S 1 чи S 2). 3а деякими рідкісними винятками, для молекул у конденсованій фазі характерна швидка релаксація на нижній коливальний рівень стану S 1 . Цей процес називається внутрішньою конверсієюі відбувається здебільшого за 10 -12 с. Оскільки типові часи згасання флуоресценціїблизькі до 10 -8, внутрішня конверсія зазвичай повністю закінчується до процесу випромінювання. Отже, випромінювання флуоресценції найчастіше здійснюється з термічно рівноважного збудженого стану. Аналогічно поглинання зворотний перехід електронів на нижній електронний рівень також призводить до коливально збудженого стану (рис. 1.3). Термічне рівновагу досягається за час 10 -12 с. Цікавим наслідком такого розгляду є те, що спектр поглинання молекули відображає коливальну структуру збуджених електронних станів, а спектр випромінювання - коливальну структуру основного електронного стану. У більшості випадків електронне збудження не сильно змінює розташування коливальних рівнів енергії. Внаслідок цього коливальні структури, які у спектрах поглинання і випромінювання, подібні.

Молекули в стані S 1 можуть також піддаватися конверсії в перший триплетний стан Т 1. Випускання з Т 1 зване фосфоресценцією, зазвичай зрушене у бік більших довжин хвиль (менших енергій) порівняно з флуоресценцією. Конверсія S 1 в Т 1 називається інтеркомбінаційною конверсією. Перехід з Т 1 в основний стан заборонений, внаслідок чого константа швидкості такого випромінювання на кілька порядків менша за відповідну константу для флуоресценції. На випуск флуоресценції можуть впливати й інші фактори, не показані в явному вигляді на рис. 1.3: вплив розчинників, релаксація розчинника, гасіння, і навіть реакції, які у збуджених станах. Всі вони будуть детально розглянуті в наступних розділах книги.
1.2 Характеристики випромінювання флуоресценції

Для явища флуоресценції відомо кілька основних характеристик. Існують і винятки, але вони рідкісні. Якщо якась із нижче перерахованих характеристик відсутня у даного флуорофору, можна зробити висновок про деякі особливі властивості цієї сполуки,

1.2.1. Стокс зрушення

Зазвичай, завжди спостерігається зсув випромінювання щодо поглинання у бік великих довжин хвиль, тобто. втрата енергії (виключення – атоми в газовій фазі). Це явище вперше спостерігав Стоке в 1852 р. у Кембриджі [4], використовуючи при цьому апаратуру, принцип дії якої зображено на рис. 1.4. Джерелом ультрафіолетового збудження служило сонячне світло, пропущене через платівку з блакитного скла. Перед приймачем як жовтий фільтр стояв склянку з вином, Флуоресценція хініну лежить в області 450 нм і тому добре помітна неозброєним оком. Нині визначення величини стоксова зсуву використовують інші методи.

Втрати енергії між збудженням та випромінюванням незмінно спостерігаються для флуоресціюючих молекул у розчинах. Однією з основних причин виникнення зсуву стоксу є швидка релаксація на нижній коливальний рівень стану S 1 . До того ж зазвичай відбувається перехід на збуджені коливальні рівні стану S0 (див. рис. 1.3), що призводить до додаткової втрати коливальної енергії.

МАЛ. 1.4. Схема першої установки виявлення стоксового зсуву.

На додаток до цього стоксів зсув може бути ще більший завдяки впливам розчинника на флуорофори і реакцій у збуджених станах. У газовій фазі у атомів і молекул не завжди є стокси зрушення. Випуск без зсуву спостерігають тоді, коли концентрації газу досить малі для того, щоб збуджені молекули не зазнавали зіткнень з іншими молекулами до процесу випромінювання. Такі зіткнення призводять до релаксації. У рідкій фазі процеси зіткнення відбуваються безперервно.
1.2.2, Незалежність спектра випромінювання від довжини хвилі збудження

Спектр випромінювання флуоресценції зазвичай залежить від довжини хвилі збудження. При збудженні на вищі електронні та коливальні рівні надлишок енергії швидко витрачається, переводячи флуорофор на нижній коливальний стан.S 1 . Ця релаксація відбувається за час порядку 10 -12 с і є, мабуть, результатом сильного перекриття безлічі станів з приблизно рівними енергіями. Завдяки такій швидкій релаксації довжина хвилі збудження зазвичай не впливає на спектр випромінювання. Існують винятки (наприклад азулен), коли випромінювання може відбуватися як з S 2 -, так і з S 1 -стану. Крім того, збудження на червоному краї спектра поглинання часто веде до зсуву флуоресценції в довгохвильову область. Цей зсув обумовлений тим, що збудження на червоному краю спектра вибірково можливе для тих флуорофорів, які найбільше взаємодіють з розчинником.

1.2.1 Правило дзеркальної симетрії

Зазвичай спектр випромінювання флуоресценції є дзеркальним відображенням спектра поглинання, точніше, того поглинання, яке відповідає переходу з S 0 в S 1. Це особливо наочно у випадку перилену (див. рис. 1.2). Симетрична природа цих спектрів визначається тим, що і поглинання, і випромінювання обумовлені тими самими переходами, а також подібністю коливальних енергетичних рівнів станів S0 і S1. Для багатьох молекул різний розподіл електронів у станах S0 та S1 істотно не впливає на ці рівні енергії. Згідно з принципом Франка – Кондона, всі електронні переходи відбуваються без зміни міжядерної відстані. В результаті, якщо дана ймовірність переходу (фактор Франка - Кондона) між нульовим та другим коливальними рівнями максимальна при поглинанні, відповідний перехід буде найімовірнішим також і у випромінюванні (рис. 1.5).

МАЛ. 1.5. Правило дзеркальної симетрії та фактори Франка – Кондона.

Необхідною умовою для дзеркальної симетрії є представлення спектрів поглинання та випромінювання у відповідних одиницях. Найкраща симетрія повинна існувати між модифікованими спектрами (v)/v та F(v)/v 3 , де  (v) - коефіцієнт поглинання, що відповідає хвильовому числу v, a F(v) - відносний потік фотонів в інтервалі хвильових чисел Δ v [5]. Відповідність між такими спектрами зазвичай спостерігається для ароматичних поліядерних вуглеводнів.

Незважаючи на те, що правило дзеркальної симетрії часто виконується, з нього існує багато винятків. Як приклад на рис. 1.6 наведено спектри флуоресценції дифенілу. У спектрі випромінювання видно коливальну структуру, яка відсутня в спектрі поглинання. Таке відхилення від правило дзеркальної симетрії зазвичай свідчить про різне геометричне розташування ядер переважно і збудженому станах.

МАЛ. 1.6. Спектри поглинання та випромінювання дифенілу.

Змішування ядер може статися до процесу випромінювання через відносно великий часу життя стану S 1 . У разі дифенілу, ймовірно, окремі кільця стають більш копланарними у збудженому стані, внаслідок чого спектр випромінювання стає структурованішим порівняно зі спектром поглинання. Дифеніл не тільки є прикладом відхилення від правила дзеркальної симетрії, він незвичайний ще й тим, що його спектр випромінювання має більш чітко виражену коливальну структуру, ніж спектр поглинання. Зазвичай спостерігається протилежна картина.

Крім геометричних перегрупувань відхилення від правила дзеркальної симетрії можуть викликати реакції в збуджених станах. Так, наприклад, для фенолу та тирозину спостерігається по дві смуги випромінювання, причому довгохвильове випромінювання більш помітно при високих концентраціях акцепторів протона (див, рис, 11,18). Величина рК а фенольної гідроксильної групи зменшується від 11 в основному до 4 стані в збудженому стані.

МАЛ. 1.7. Спектри випромінювання пірена та його ексимера (за даними).

Відносна інтенсивність максимуму флуоресценції ексимера (470 нм) зменшується при зниженні концентрації пірена від 6x10 - 3 М (верхня крива) до 0,9x10 -1 М (нижня крива).
Слідом за збудженням фенольний протон переходить до акцепторів протону в розчині. Залежно від концентрації цих акцепторів у спектрі випромінювання може переважати флуоресценція або фенолу, або феноляту. Примітно те, що навіть незважаючи на відсутність активних груп, багато поліядерних ароматичних вуглеводнів також вступають в реакції в збуджених станах. Так, наприклад, молекули пірена у збудженому стані об'єднуються у комплексизвані ексімерами (скорочення від excited dimers - збуджені димери). Випускання ексимерів змішане в довгохвильову область порівняно з випромінюванням мономерів пірена, в ньому відсутня коливальна структура (рис.1.7). Комплекси, що утворюються у збудженому стані, називають ексіплекс.
1.3. Часи згасання та квантові виходи флуоресценції

Часто вимірюють часи згасання та квантові виходи флуоресціюючих сполук. Сенс цих параметрів добре видно із модифікованої діаграми Яблонського (рис. 1.8). На цій діаграмі ми детально не вказуємо окремі процеси релаксації, що призводять до релаксованого стану S 1 , а звертаємо велику увагу на процеси, які відповідальні за повернення в основний стан. Зокрема, нас цікавить константа швидкості випромінювальної дезактивації флуорофору (Г) та константа швидкості безвипромінювальної дезактивації у стан S 0 (k).

Квантовий вихід флуоресценції- це відношення числа випущених фотонів до поглинених. Обидві константи швидкості Г та k відповідають процесам зменшення заселеності збудженого стану. Частка молекул флуорофору, які дезактивуються з випромінюванням, а отже, і квантовий вихід визначаються виразом

Q = Р/(Р+k) (1.2)

Квантовий вихід близький до одиниці в тому випадку, якщо константа швидкості безвипромінювальної дезактивації набагато менша за константу швидкості випромінювання, тобто k « Г. Зауважимо, що енергетичний вихід флуоресценції завжди менше одиниці через стоксові втрати. Для зручності ми згрупували всі можливі процеси безвипромінної дезактивації одну константу швидкості k.

МАЛ. 1.8. Модифікована діаграма Яблонської.

Час життя збудженого стану визначається як середній час, протягом якого молекула перебувала у збудженому стані до того, як повернутися до основного стану. Зазвичай час згасання флуоресценції -10 нс, Для флуорофора, що описується діаграмою Яблонського (рис. 1.8), час згасання дорівнює

τ = 1/(Г+k) (1.3)

Необхідно пам'ятати, що випромінювання флуоресценції - це випадковий прохід.
цес і в повному обсязі молекули випускають фотони при t = τ. Час життя – це
середня тривалість перебування у збудженому стані. У примі
ре для одноекспоненційного згасання, наведеному в гол. 3, 63% молекул гине під час t = τ, а 37% - за час t > τ. Час життя флуорофору без безвипромінювальних процесів, зване власним часом життя *,τ 0 , дорівнює

τ 0 = 1/Г (1.4)

Звідси випливає звичайне співвідношення між квантовим виходом та часом
нім життя:

Q = τ / τ 0 (1.5)

Квантовий вихід та час життя можуть змінюватися під дією будь-яких факторів, що впливають на константи швидкості. Наприклад, молекула може виявитися нездатною флуоресцировать через велику швидкість внутрішньої конверсії чи мінімальної швидкості випромінювання. Сцинтилятори зазвичай вибирають за їхні високі квантові виходи, Які є результатом великих значень Г. Їм зазвичай відповідають короткі часи життя, близько 1 нс. Флуоресценція ароматичних сполук, що містять групи N0 2 зазвичай слабка, в першу чергу через велику величину k. Перехід триплет-синглет заборонений по симетрії, і константи швидкості спонтанного випромінювання становлять ~10 3 с-1 або менше **. Оскільки значення k близькі до 10 9 с-1 квантові виходи фосфоресценції малі при кімнатній температурі. З рівняння (1.2) можна отримати квантові виходи фосфоресценції, що дорівнює 10 -6 .

* Правильніше називати його радіаційним (випромінювальним) часом життя. - Прим. ред.

** Автор наводить надто велике значення k для внутрішньомолекулярної безвипромінювальної дезактивації триплетних станів, яка зустрічається рідко – лише для молекул, що зазнають хімічних перетворень (зокрема, ізомеризації). Через спинову заборону безвипромінювальний інтеркомбінаційний перехід Т 1 → S 0 для більшості молекул має константи швидкості k 1.4. Анізотропія флуоресценції

Флуорофори переважно поглинають ті фотони, електричні вектори яких спрямовані паралельно моменту переходу флуорофору. Момент переходу має певну орієнтацію у молекулі флуорофора. В ізотропних розчинах молекули флуорофорів орієнтовані випадковим чином. При збудженні поляризованим світлом селективно збуджуються ті молекули флуорофору, для яких дипольний момент переходу при поглинанні паралельний електричному вектору збуджуючого світла (див. Розд. 5.2.1). Таке селективне збудження частково орієнтованого набору флуорофорів (фотоселекція) призводить до частково поляризованого випромінювання флуоресценції. Для кожного флуорофора моменти переходу для поглинання та випромінювання мають фіксовану орієнтацію, і кут між ними визначає максимальну вимірювану анізотропію r 0 див. рівняння (5.20)]. Анізотропія (r) та поляризація (Р) флуоресценції виражаються рівняннями

(1.6), (1.7)

де I || і I ┴ інтенсивності флуоресценції вертикально (II) та горизонтально (┴) поляризованого випромінювання у разі порушення зразка вертикально поляризованим світлом. Анізотропія і поляризація - це вирази того самого явища, тому їх можна взаємозамінювати, використовуючи рівняння (5.3) і (5.4). Деякі фактори можуть зменшувати вимірювану величину анізотропії до значень нижче максимального. Найпоширеніший з них - обертальна дифузія, яка відбувається за час життя збудженого стану і зміщує флуорофора, що випускає диполь. Вимірювання цього параметра дає інформацію про відносне кутове змішування флуорофора в інтервалі між поглинанням та випромінюванням. Перенесення енергії збудження між флуорофорами також призводить до зменшення анізотропії.

Припустимо, що єдиним суттєвим процесом, що призводить до зменшення анізотропії, є обертальна дифузія. Тоді вимірювана анізотропія визначиться виразом

де r 0 - анізотропія, яка повинна була б вимірюватися за відсутності обертальної дифузії, а φ - час кореляції для процесу дифузії, що визначається як

φ = ηV/kТ (1.9)

де η - в'язкість розчину; k – константа Больцмана; Т – абсолютна температура; V -об'єм фрагмента, що обертається. Розглянемо білок з молекулярною масою 50 000. Оскільки питомий об'єм білків становить 0,73 мл/г, можна легко підрахувати, що при 25° С у водному розчині (n = 0,00894 П) очікуваний час кореляції становить 13 нc для безводної сфери. Оскільки білки гідраговані, фактичний час кореляції, мабуть, має бути більшим. Однак суттєвим є те, що часи обертальної кореляції для більшості білків можна порівняти з типовими часами загасання флуоресценції. Тому результати вимірювання анізотропії флуоресценції залежать від усіх факторів, що впливають швидкість обертальної дифузії. Тому вимірювання поляризації флуоресценції широко використовують для вивчення гідродинамічних властивостей макромолекул.

1.5. Тимчасова шкала молекулярних процесів у розчині

Флуоресцентна спектроскопія – ефективний метод дослідження динамічних процесів у розчинах, що становлять інтерес для біологів. Така можливість пов'язана насамперед із часом життя збуджених станів. Внаслідок принципу Франка – Кондона абсорбційна спектроскопія може дати інформацію лише про усереднені характеристики основного стану молекул, що поглинули світло. Оскільки тільки ті мо-ієкули розчинника, які безпосередньо сусідять з поглинаючими частинками, впливатимуть на їх спектр поглинання, абсорбційна спектроскопія може дати інформацію лише про деяку середню сольватну оболонку розчинника, що сусідить з хромофором, і не відображає молекулярну динаміку.

На противагу цьому параметри флуоресцентної спектроскопії є чутливими. функціями всіх процесів, що протікають протягом життя збудженого стану, причому у цих процесах можуть брати участь молекули, що у момент збудження з відривах до 100 А флуорофора. Хоча може здатися, що 10 нс - надто короткий проміжок часу, фактично це великий час у порівнянні з часом руху малих молекул у рідкому розчині. Обертальна дифузія пов'язаних з білками і мембранами флуорофорів також укладається в цей часовий діапазон.

Гасіння флуоресценції молекулярним киснем за механізмом зіткнень є показовим прикладом розмірів просторового та тимчасового діапазонів, що представляються часом затихання флуоресценції. Якщо флуорофор, що у збудженому стані, стикається з молекулою кисню, він повертається у основний стан без випромінювання фотона. Коефіцієнт дифузії кисню у воді при 25 ° С дорівнює 25 10 -3 см 2 /с. Середня відстань [(Δх 2) 1/2], на яку може дифундувати молекула кисню за 10 -3 с, визначається рівнянням Ейнштейна:

Δ x 2 = 2Dτ (1.10)

Відстань [(Δх 2) 1/2] становить ~ 70 Å, що порівняно з товщиною біологічної мембрани або діаметром білка. Для деяких флуорофорів часи життя досягають 400 нc, тому можна спостерігати дифузію молекул кисню на відстані понад 450 А. Навпаки, вимірювання поглинання дають відомості лише про безпосереднє оточення флуорофору і, отже, про миттєве середнє оточення.

Вплив молекулярної динаміки на спектри флуоресценції також виявляється під час розгляду енергій. Органічні молекули, як правило, поглинають світло в діапазоні довжин хвиль 200-500 нм, що відповідає енергіям від 140 до 60 ккал/моль. Після поглинанням у флуорофора змінюється (зазвичай зростає) дипольний момент. Якщо молекули розчинника також мають дипольні моменти, вони переорієнтуються навколо диполя збудженого стану, знижуючи цим його енергію. Цей процес називається релаксацією розчинника та відбувається у рідких розчинах за 10 -12 с. Релаксація розчинника може призводити до значних зсувів стоксів. У білках триптофанові залишки поглинають світло з довжиною хвилі 280 нм, а флуоресценцію випускають при -350 нм. Таким чином, за кілька наносекунд, що проходять до процесу випромінювання, витрачається 20 ккал/моль.

В основі будь-якого експерименту лежать вимір деякої величини та кореляція отриманих результатів з явищем, що становить інтерес для дослідника. Тимчасовий діапазон між поглинанням світла і подальшим його випромінюванням достатній для протікання декількох процесів, кожен з яких призводить до ослаблення спектральних спектральних характеристик флуоресценції. До таких процесів відносяться зіткнення з гасниками, обертальна та поступальна дифузія, утворення комплексів з розчинниками або з розчиненими речовинами та переорієнтація оточення молекули у збудженому стані із зміненим дипольним моментом. Ці динамічні процеси можуть впливати на анізотропію флуоресценції, квантові виходи, часи життя та спектри випромінювання. В результаті спектральні характеристики флуорофорів можуть дати велику інформацію про динамічні процеси, що протікають за час випромінювання флуоресценції.

1.6. Флуорофори

1.6.1 Природні флуорофори

З великої кількості молекул біологічних речовин багато хто є природними, або природними, флуорофорами. Ми коротко підсумовуємо інформацію про широко відомі флуорофорищо дає основу для наступних розділів. Такий конспективний виклад не є вичерпним.

БІЛКИ Триптафан - найбільш інтенсивно флуоресцентна амінокислота в білках. Близько 90% усієї флуоресценції білків зазвичай зумовлено триптофановими залишками. "Цей природний флуорофор вкрай чутливий до полярності навколишнього середовища. Спектральні зрушення часто є наслідком кількох явищ, серед яких можна виділити зв'язування лігандів, асоціацію білок - білок і денатурацію. Крім того, максимуми випромінювання білків відображають середню доступність їх триптофанових залишків. поглинають світло близько 280 нм, а максимуми спектрів флуоресценції лежать в області 320 -350 нм.

Тирозин інтенсивно флуоресціює в розчині, проте в білках його флуоресценція значно слабша. Денатурація білків зазвичай посилює випромінювання тирозину. Як і для фенолу, рак тирозину дуже сильно зменшується при збудженні, і може відбуватися іонізація в збудженому стані.

Нуклеїнові кислоти Нуклеотиди та нуклеїнові кислоти зазвичай не флуоресціюють. Проте є деякі винятки. tRNA Phe із дріжджів містить інтенсивно флуоресцентну основу, відому як Y-основу, яка має максимум випромінювання поблизу 470 нм, а час життя ~6 нc.

Кофактори NADH флуоресціює сильно, і максимуми його поглинання та випромінювання знаходяться при 340 і 450 нм відповідно. NAD + не флуоресціює. Час загасання флуоресценції NADH у водному буфері становить приблизно 0,4 нс. Флуоресцентною групою є відновлене нікотинамідне кільце, причому його флуоресценція частково загашена за рахунок зіткнень із залишком аденіну. При зв'язуванні NADH з білками квантовий вихід флуоресценції збільшується зазвичай у чотири рази. Таке збільшення виходу зазвичай інтерпретують як наслідок зв'язування NADH у витягнутій конформації, що підтверджується вивченням дифракції рентгенівських променів гідрогеназах.

РИБОФЛАВІН І FAD. Рибофлавін, FMN (флавінмононуклеотид) і FAD (флавінаденіндинуклеотид) поглинають світло у видимій області (-450 нм) і випускають в області 515 нм. Типові часи життя для FMN та FAD становлять 4,7 та 2,3 нс відповідно. Як і для NADH, флуоресценція флавіна динамічно гаситься аденіном. Далі, FAD також утворює комплекс-симсоціати, в яких флуоресценція флавна загашена аденіном (статичне гасіння). Флагопротеїни в основному не флуоресціюють, проте знову ж таки існують винятки.

1.6.2. Штучні фпуорофори

Часто природні флуоресцентні властивості макромолекул неможливо отримати з експерименту бажану інформацію. Так, наприклад, флуоресценція білка і навіть поляризація цієї флуоресценції не відображають явище, яке хочуть охарактеризувати кількісно.

ІЗОЦІАНАТИ ТА ІЗОЦІОЦІАНАТИ ФЛУОРЕСЦЕЇНУ ТА РОДАМІНУ. Ці барвники широко використовують як мітки для білків. Мічені флуоресцеїном імуноглобуліни – комерційні реактиви; їх часто використовують у флуоресцентній мікроскопії. Саме ці речовини вибирають через високі квантові виходи та стійкість до фото знебарвлення. Крім того, завдяки великим довжинам хвиль поглинання та випромінювання (рис. 1,9) зведена до мінімуму проблема фонової флуоресценції біологічних зразків і можна уникнути застосування кварцової оптики. Ізоціанатна або ізотіоціанатна групи знаходяться або в мета-, або в параположенні до карбокси-групи (див. рис, l.l). Комерційні мічені реагенти є сумішшю ізомерів. Ці барвники реагують насамперед із лізиновим чи цистеїновим ділянкою білків. Часи загасання флуоресценції барвників близько 4 нс, які спектри випромінювання мало чутливі до полярності розчинника. Ці барвники дуже підходять для кількісного визначення ступеня асоціації невеликих мічених молекул із білками на підставі зміни поляризації флуоресценції.

Дансілхлорид. Дансилхлорид (DNS-C1) широко використовують як мітку для білків (рис. 1.10), особливо в тих випадках, коли проводять вимірювання поляризації. Ця речовина давно відома [8] і має зручне вре-ся життя флуоресценції (~ 10 нс). На спектр випромінювання дансильної групи сильно впливає полярність розчинника.

МАЛ. 1.9. Спектри збудження та випромінювання бичачого γ-глобуліну. міченого зотіоціанатом флуоресцеїну (за даними [7]).

МАЛ. 1.10. Штучні флуорофори, що часто використовуються.

Нафтиламінсульфонові кислоти, 1-Аніліно-8-нафталінсульфоно-в'яка кислота (l,8-ATS або ANS), 2-n-толуїдинілнафталін-б-сульфонова кислота (2,6-TNS або TNS) та їх похідні часто використовують як нековалентно пов'язаних зондів для білків та мембран. Ці зонди майже не флуоресцируют у воді, але інтенсивно флуоресцируют або при розчиненні в неполярних розчинниках або коли вони пов'язані з макромолекулами. Низький квантовий вихід у водній фазі дозволяє у багатьох випадках не враховувати цю частину флуорофорущо спрощує експерименти. Подібні флуорофори зв'язуються із сироватковими альбумінами, ліпопротеїнами, апоміоглобіном, імуноглобулінами та ліпідними бислоями. Місця зв'язування мають, мабуть, як полярну, так і неполярну природу.

Гідрофобні мембранні зонди. Ліпіди зазвичай не флуоресціюють. Мембрани часто мітять такими зондами, як перилен, 9-вінілантраЦен та 1,6-дифенілгексатрієн (DРН) (рис. 1.10). Ці зонди нерозчинні у воді та вбудовуються у гідрофобні ділянки мембран. Незаміщені багатоядерні ароматичні вуглеводні та DPH малочутливі до полярності розчинника. Їх використовують у першу чергу для оцінки внутрішньої в'язкості подвійних шарів за вимірами поляризації їхньої флуоресценції (розд. 5.7.1). Шляхом цілеспрямованої зміни хімічної будови зонди можуть бути локалізовані на вибраних ділянках мембрани. Одним із таких прикладів є триметиламонієва сіль DPH (ТМA-DPH). Вважають, що заряджений атом азоту призводить до локалізації ТМА-DPH в області ліпідно-водної межі мембран [14].

Інші зонди, як, наприклад, PATMAN (рис. 1.11), дуже чутливі до фазового стану ліпідних бислоев [9]. При температурі перебудови мембран спектр випромінювання РАТМАН спалюється на 40 нм у довгохвильову область: від 425 до 465 нм. Очевидно, цей зонд реагує на релаксацію мембрани навколо диполі збудженого стану флуорофора (розд. 8.6). Було запропоновано й інші зонди. Чутливість до потенціалу мембрани може бути пов'язана зі зміною орієнтації зонда або його локальної концентрації в мембрані, а також з впливом електричного поля електронний розподіл в зонді [11]. І нарешті, можна виділити зонди, які зазнають реакцій у збудженому стані. У збудженому стані зонд Р 2 -З 3 може утворювати внутрішньомолекулярний ексімер, і частка ексімерів, що утворилися, визначає в'язкість в їх найближчому оточенні.

Нуклеїнові кислоти. При введенні етиленового містка флуоресценція АТР та його похідних стає інтенсивнішою [12]. Такі похідні ε-АТР (рис. 1.11) чутливі до в'язкості розчинника, мають високу граничну поляризацію флуоресценції, і часи загасання їхньої флуоресценції близькі до 23 нс. Нуклеотидні аналоги активні у багатьох реакціях, що каталізуються ферментами. Крім того, були синтезовані такі аналоги нуклеотидів з витягнутою конформацією, як лін-бен-зо-АМР.

Підсумовуючи, можна сказати, що флуоресценцією мають різноманітні молекули і спектральні властивості флуорофорів впливає низку чинників і процесів. Як наслідок цього, флуоресцентні методи корисні вивчення властивостей розчинів і біологічних макромолекул.

МАЛ. 1.11. Штучні флуорофори, що часто використовуються.

Є. О. Пучков,
доктор біологічних наук, Інститут біохімії та фізіології мікроорганізмів ім. Г. К. Скрябіна РАН
«Хімія та життя» №9, 2014

Одразу дві статті цього номера «Хімії та життя» розповідають про світіння біооб'єктів. На фото зліва - малощетинковий черв'як Fridericia heliotaвідкритий вченими з Красноярського університету. Про те, як був досліджений його люциферин – речовина, яка при окисленні ферментом люциферазою випромінює блакитне світло, – читайте у статті «Вогники під ногами». На фото справа – синтетичний люциферин фридериції у присутності АТФ та інших необхідних компонентів демонструє таке ж свічення, як і екстракт білкового черв'яка. Це підтверджує, що структура люциферину встановлена правильно.

На відміну від флуоресцентних мікроскопів, проточні цитометри не дають можливості помилуватися флуоресцентними об'єктами. Їхня сильна сторона - швидкість реєстрації сигналів від одиничних об'єктів, наприклад від клітин у суспензії. Звичайний комерційно доступний цитометр працює зі швидкістю 1000 клітин на секунду, а спеціалізовані високопродуктивні - до 25 000 клітин на секунду! У стандартному варіанті у кожного об'єкта вимірюються від двох до десяти параметрів: світлорозсіювання та флуоресценції одного або кількох флуорофорів. Таким чином можна отримати статистично достовірні результати гетерогенності клітинних, зокрема мікробних, популяцій. Існують також прилади, здатні сортувати клітини за певними параметрами світлорозсіювання або флуоресценції, щоб вивчати субпопуляції з використанням інших методів.

...І що з них можна дізнатися

Отже, всі флуоресцентні репортери мають спеціалізацію, тобто здатні вибірково характеризувати певні властивості біологічної системи. Зупинимося коротко на деяких категоріях «фахівців».

За допомогою низки флуоресцентних репортерів (як правило, органічних флуорофорів) можна стежити за ферментативним каталізом - дослідити динаміку ферментативних реакцій, їх локалізацію в клітинах, тканинах, органах тощо. Це, наприклад, субстрати з ковалентно приєднаними флуорофорами, які починають після вивільнення в ході реакції, або профлуорофори, що стають флуоресцентними при взаємодії з продуктом реакції.

Репортери, сформовані на основі антитіл - фізичні комплекси або ковалентні сполуки флуорофорів з антитілами - інформують про перебіг імунологічних реакцій. Флуоресціюючим компонентом може бути будь-який з відомих органічних і неорганічних флуорофорів, включаючи квантові точки. Крім того, до антитіл можна приєднувати ферменти, що каталізують реакції з утворенням флуоресцентного продукту. Сучасні технології дозволяють отримати антитіла до будь-якого білка (антигена), що цікавить дослідника, антитіло з флуоресцентною міткою змусить світитися цей білок або структуру, з нього побудовану. Наприклад, за допомогою флуоресцентних антитіл виявлено мікрофібрили у фібробластах мишей (див. фото на другій сторінці обкладинки).

Дуже інформативними є методи з використанням флуоресцентних білків (ФБ). Ми вже згадували про те, наскільки корисні методи впровадження в клітину генів гібридних білків, які змушують флуоресціювати природний білок або навіть нуклеїнову кислоту. До того ж флуоресценція ФБ-гібридних білків, що містять, залежить від кислотності середовища, що дозволяє вимірювати рН не тільки всередині клітини, але і всередині окремих органел, якщо такий білок «адресований» в ядро або мітохондрію.

Особливий інтерес викликає застосування ФБ у поєднанні з методиками вимірювання флуоресценції, що ґрунтуються на безвипромінювальній передачі енергії. Уявіть собі два гібридні білки, один з яких змушує флуоресціювати інший при зближенні. Подібним чином можна вивчати конформаційні (структурні) зміни в білках, якщо приєднати ФБ до різних ділянок однієї білкової молекули.

Чутливість флуоресценції до фізичних властивостей мікрооточення флуорофорів дозволяє використовувати деяких з них як репортери різних параметрів внутрішньоклітинного середовища. Серед них, наприклад, в'язкість цитоплазми, внутрішнього вмісту органел, гідрофобного шару біомембран. Взаємодія деяких флуорофорів із біологічними мембранами залежить від різниці електричних потенціалів на мембрані: за допомогою таких репортерів одержують відомості про величину мембранного потенціалу. Існують навіть репортери для вимірювання внутрішньоклітинної температури!

Не тільки на око

Можливості зорового аналізу обмежені переважно якісною оцінкою: «є світіння - немає світіння». Набагато більше інформації дають кількісні характеристики (див. розділ «Мова флуоресцентних репортерів»).

Для кількісної характеристики флуоресценції використовують дві методології. Перша служить для вимірювання різних характеристик флуоресценції в порівняно великій (макроскопічній) області об'єкта, що забезпечує отримання усереднених характеристик по об'єкту: розчину, суспензії колоїдних частинок, клітин, субклітинних частинок і т.п. та субклітинні частки.

Вимірювання інтегральної флуоресценції проводять за допомогою спектрофлуориметрів (флуоресцентних спектрофотометрів) та планшетних флуориметрів (англ. plate readers). Спектрофлуориметри-це, як правило, аналітичні прилади, на яких можна отримати всі основні характеристики флуоресценції. Планшетні флуориметри - пристрої для аналізу великої кількості зразків (іноді більше тисяч), але лише за декількома фіксованими характеристиками, наприклад, за інтенсивністю флуоресценції у певній спектральній області та/або за часом життя флуорофорів у збудженому стані. Більшість методик з використанням планшетних флуориметрів ґрунтується на імунологічних реакціях або на аналізі розвитку культур клітин у моношарах.

Методологія вимірів флуоресценції одиничних мікроскопічних об'єктів також має два варіанти.

Перший ґрунтується на отриманні цифрових зображень об'єктів з подальшим комп'ютерним аналізом. Другий – на «поштучному» вимірі флуоресценції мікрооб'єктів у потоці, при проходженні через вузький капіляр спеціального приладу – проточного цитометра.

Флуоресцентна мікроскопія нещодавно пережила справжню революцію: розроблено нові пристрої, насамперед конфокальні мікроскопи, в яких збудження та реєстрація флуоресценції здійснюються через мікроскопічний отвір, що відсікає «зайве» свічення, яке виникає поза фокусом об'єктива. Ця "зіниця" сканує зображення в горизонтальній та/або вертикальній площині, сигнали реєструє фотопомножувач, і після їх комп'ютерної обробки виходить просторове зображення об'єкта. Така конструкція дозволяє отримувати більш чіткі порівняно зі стандартними мікроскопами двовимірні та тривимірні зображення. Крім того, на сучасних конфокальних мікроскопах можна проводити вимірювання параметрів згасання флуоресценції.

Ще один тип «революційних» мікроскопів функціонує, начебто, всупереч основним фізичним принципам флуоресценції. Атоми в них збуджуються світлом із довжиною хвилі, більшою, ніж у флуоресценції, а не меншою. Насправді ніякі закони фізики при роботі цих мікроскопів не порушуються, просто при достатній інтенсивності світлового потоку з більшою довжиною хвилі в той самий атом одночасно можуть потрапити два фотони, поглинена електронами енергія подвоюється, і її виявляється достатньо для збудження флуоресценції. Тому такі мікроскопи називаються двофотонними. А оскільки світловий потік максимально сконцентрований у фокусі об'єктива, забезпечується умова високої роздільної здатності зображень. Двофотонні мікроскопи відрізняє також здатність реєструвати флуоресценцію у зразках на глибині до 1,5 мм і можливість суттєво зменшити несприятливу дію збуджуючого випромінювання як на об'єкти, що досліджуються, так і на флуоресцентні репортери.

Кількісну інформацію із цифрових зображень витягують за допомогою комп'ютерних програм аналізу зображень. Вимірюють інтенсивність флуоресценції та її просторовий розподіл, оцінюють спектральні характеристики випромінювання, визначають кількість флуоресціюючих частинок, наприклад клітин, характеризують тимчасові та поляризаційні параметри флуоресценції. Спеціальні аналітичні прийоми (так звана флуоресцентна кореляційна спектроскопія) дозволяють використовувати конфокальну та двофотонну мікроскопію для дослідження руху навіть одиничних флуоресціюючих молекул!

Що висвітлили у мікросвіті флуоресцентні репортери

Флуоресцентні репортери довго і успішно служать у багатьох, якщо не в усіх сферах експериментальної біології. Однак є такі галузі, де вони відіграли ключову роль.

З використанням флуоресцентних репортерів було експериментально доведено модель рідкокристалічної структури всіх біологічних мембран. Згідно з цією моделлю, при всій її структурній цілісності мембрана досить «рідка», щоб окремі її компоненти могли переміщатися у потрібні сторони. Таке уявлення дозволяє зрозуміти основні молекулярні механізми функціонування мембран, і навіть властивості живих клітин у цілому.

Значною мірою завдяки інформації від флуоресцентних репортерів прояснилися механізми трансформації енергії у клітинах. Особливу роль тут відіграли флуорофори, що дозволяють реєструвати внутрішньоклітинний та внутрішньомітохондріальний рН, а також різницю електричних потенціалів на мембранах. З їх допомогою насамперед було виявлено механізм поєднання енергодонорних реакцій окислення з енерговитратним синтезом аденозинтрифосфату (АТФ) – універсального постачальника енергії для більшості метаболічних процесів. Крім того, була вивчена природа накопичення різних речовин у цитоплазмі та в клітинних органелах за рахунок мембранного електричного потенціалу та градієнта рН.

Життєдіяльність клітин забезпечується сукупністю скоординованих у просторі та часі біохімічних реакцій, а за координацію відповідають так звані сигнальні системи. Основні компоненти цих систем були ізольовані та охарактеризовані за допомогою методів традиційної біохімії та молекулярної біології. Однак тільки підходи, засновані на застосуванні флуоресцентних репортерів, показали безпосередньо, де пролягають ці шляхи і як по них проходять сигнали, - стало можливим у реальному часі стежити за взаємодією сигнальних білків або оцінювати динаміку експресії генів окремо взятій клітині. За допомогою флуоресцентних репортерів вдалося виявити і невідомі раніше сигнальні компоненти, наприклад, виявити роль іонів Са +2 як сигнального посередника в багатьох регуляторних реакціях.

У другій половині ХХ століття у мікробіології виникла проблема, яку назвали «великою аномалією обліку мікроорганізмів за допомогою чашок Петрі». «Винниками» виявилися флуоресцентні репортери, два барвники нуклеїнових кислот – акридиновий помаранчевий та 4,6-діамідіно-2-феніліндол. Оцінити вміст мікроорганізмів у природному зразку можна або підраховуючи колонії, що виросли на чашці Петрі (при достатньому розведенні «посівного матеріалу» кожну колонію утворюють нащадки лише однієї клітини), або безпосередньо підраховуючи під мікроскопом самі мікроорганізми, фарбовані флуоресцентними барвниками нуклеїнових. Так от, флуоресцентні репортери завжди виявляли значно більше мікроорганізмів, ніж аналіз із чашками Петрі.

Для пояснення цього протиріччя було висунуто дві гіпотези. Згідно з першою, частина клітин, які перебувають у стані спокою, не розмножується на чашках Петрі. Згідно з другою, умови культивування (склад середовища, температура та ін) не відповідають потребам деякої частини популяції. Перевірка цих гіпотез показала, що можливе і те, й інше. Більше того, було дано поштовх до формування двох нових великих напрямів досліджень. Перше пов'язане з вивченням так званого життєздатного, але не культивується стану мікроорганізмів. Зрозуміла практична значущість таких досліджень: наприклад, патогени людини у цьому стані можуть бути невидимі для стандартних методів діагностики та стійкіші до лікарських препаратів. Другий напрямок - виявлення та вивчення мікроорганізмів у природних зразках шляхом прямого аналізу їх нуклеїнових кислот, без попереднього отримання чистих культур, як це робилося раніше. Цей напрямок отримав власну назву - метагеноміка. Завдяки методам метагеноміки (до речі, деякі з цих методів припускають використання флуоресцентних репортерів) з'явилася можливість по-новому побачити біологічну різноманітність мікроорганізмів в окремих екосистемах та на Землі загалом.

Отже, сучасні флуоресцентні репортери - це величезна армія фахівців, і багато хто з них уже має гучну славу в експериментальній біології. Їхні репортажі дозволили краще розглянути ті куточки мікросвіту, куди може заглянути світло. Однак багато дослідників, що працюють у цій галузі, вважають, що все, побачене нами у світлі флуоресценції досі, – це лише початок!

Усі речовини при сильному нагріванні починають випромінювати електромагнітну енергію. Випромінювання нагрітих речовин називають тепловим рівноважним випромінюванням. Однак деякі речовини випромінюють електромагнітну енергію без нагрівання при кімнатній температурі. Таке випромінювання називають люмінесценцією, а люмінесцентні речовини – люмінофор. На відміну від теплового, люмінесценція є нерівноважним випромінюванням.

За В. Л. Левшину, люмінесценція- це світіння атомів, молекул, іонів та інших складніших комплексів, що виникає в результаті електронного переходу в цих частках при їх поверненні зі збудженого стану в нормальний.

Метод молекулярної люмінесцентної спектроскопії характеризується високою чутливістю (порядок виявлення 10 -3 мг/мл), оскільки відноситься до силових – вихідний сигнал збільшується із збільшенням інтенсивності джерела випромінювання. В ідеальних умовах вдається досягти меж виявлення на рівні пікограмів у мілілітрі.

У рефераті наведено класифікацію методів люмінесценції за способом збудження, механізмом і тривалістю, описані схеми Яблонського.

2. Класифікація методів люмінесценції

2.1 За способом збудження

З визначення люмінесценції слід, що її збудження необхідно підводити енергію ззовні, оскільки вона втрачається при випромінюванні. Тому види люмінесценції природно класифікувати за зовнішнім джерелом збудження енергії.

Джерело збудження	Вид люмінесценції
Електромагнітне випромінювання видимої та ультрафіолетової області спектру	фотолюмінесценція
Потік електронів (катодні промені)	Катодолюмінесценція
Потік іонів лужних металів у вакуумі	Іонолюмінесценція
Рентгенівське випромінювання	Рентгенолюмінесценція
Радіоактивне випромінювання	Радіолюмінесценція
Теплова енергія	Термолюмінесценція (кандолюмінесценція)
Ультразвук	Сонолюмінесценція
Механічне вплив	Триболюмінесценція
Енергія хімічних реакцій	Хемолюмінесценція
Енергія біологічних процесів	Біолюмінесценція

Найчастіше в аналітичній практиці використовують фотолюмінесценцію та хемілюмінесценцію.

2.2 За тривалістю

Тип люмінесценції залежить від цього, які переходи здійснюються в молекулі при поглинанні нею квантів збуджуючого випромінювання.
Молекулярна люмінесценція за тривалістю та спектральним складом:

Флуоресценція (ФЛ)
короткочасна
сповільнена
Фосфоресценції (Фс)

Випускання фотонів флуоресценції відбувається при переході електрона з нульового коливального рівня стану будь-який коливальний рівень основного стану. Флуоресценція є короткочасним випромінюванням тривалістю 10 -10 -10 -7 секунд і спостерігається при кімнатній температурі. Енергія фотонів флуоресценції менше енергії фотонів поглинання.

За певних умов (зазвичай при температурі -196 ° С, відсутність парамагнітних молекул) для триплетних молекул виявляється можливим заборонений перехід з випромінюванням фотонів фосфоресценції. Це випромінювання має значно більшу тривалість 10 -4 -10 -2 секунд. Енергія фотонів фосфоресценції менше енергії фотонів короткочасної флуоресценції.

Крім флуоресценції та фосфоресценції існує ще один вид люмінесценції, який ідентичний за спектральним складом флуоресценції, але характеризується тривалістю, властивою фосфоресценції. Цей вид люмінесценції називають уповільненою флуоресценцією, оскільки перед випромінюванням фотонів молекула деякий час перебуває в триплетном стані. Порівняно з флуоресценцією та фосфоресценцією її інтенсивність невелика і досягає максимальних значень при кімнатній та вищих температурах, помітно слабшаючи зі зниженням температури.

2.3 За механізмом світіння

Світіння дискретних центрів

резонансна (Малюнок 1а) – квант випромінювання, що випускається часткою, дорівнює поглиненому кванту.
спонтанна (Малюнок 1б) – виникає під час переходу частки з збудженого рівня 2 на основний рівень. Рівень випромінювання 2 лежить нижче рівня 3, тому квант, що випромінюється, виявляється менше поглиненого.
вимушена (Малюнок 1в) – збуджена частка, перш ніж перейти на випромінювальний рівень 2, виявляється на проміжному метастабільному рівні 4, безпосередній перехід з якого на основний рівень є забороненим. Для переходу на випромінювальний рівень 2 частинці необхідно повідомити додаткову енергію у вигляді тепла чи світла.

Малюнок 1. Схеми енергетичних рівнів та електронних переходів.

1 – основний рівень; 2, 3 – збуджені рівні; 4 – метастабільний рівень; - Поглинання; ↓ – люмінесценція;

Поглинаючими і випромінюючими центрами є одні й самі частинки (атоми, іони чи молекули). Цей вид світіння властивий в основному речовин у газоподібному стані, органічних і неорганічних речовин у розчинах і чистих органічних речовин.

Резонансна люмінесценція характерна переважно для атомів, найпростіших молекул, що знаходяться в газоподібному стані при низьких тисках, спонтанна - для пар і розчинів складних молекул, вимушена - для складних органічних молекул, що знаходяться при низькій температурі або поміщених у в'язкі або склоподібні середовища (полімерні плівки, цукрові льодяники).

Рекомбінаційне світіння

Акти поглинання та випромінювання розділені не лише у часі, а й просторово. У процесі збудження відбувається розподіл частки на дві протилежно заряджені. Послідовність їхньої рекомбінації супроводжується виділенням енергії. Цей вид світіння є основним у світінні кристалофосфорів – складних кристалічних речовин з дефектною структурою.

3. Схеми Яблонського

Поглинання та випромінювання світла добре ілюструє діаграма рівнів енергії, запропонована Яблонським (Малюнок 2).

Рисунок 2. Діаграма рівнів енергії Яблонської

Основний, перший і другий електронні стани позначають S 0 , S 1 і S 2 відповідно.
Кожен із цих рівнів енергії може складатися з безлічі коливальних енергетичних рівнів, що позначаються 0, 1, 2 і т. д. Вплив розчинника до уваги не береться.

Переходи між різними електронними рівнями позначені вертикальними лініями. Така вистава використовується, щоб наочно показати миттєву природу поглинання світла. Цей процес відбувається приблизно за 10-15 с, час занадто короткий для помітного зміщення ядер (принцип Франка-Кондона).

У збуджених станах молекули знаходяться дуже недовго (у синглетному стані зазвичай значно менше, ніж у триплетному) і стають дуже реакційними.

Відповідно до розподілу Больцмана, при кімнатній температурі більшість молекул знаходяться на нижньому коливальному рівні основного синглетного стану S0. Саме такі молекули переважно і поглинатимуть випромінювання.

Через велику різницю енергій між рівнями S0 і S1 по суті, у жодних флуорофорів стан S1 не може бути заселений термічним шляхом. Навіть мале термічно активоване заселення першого збудженого коливального стану молекул можна зареєструвати, використовуючи відмінність спектрів поглинання за різних температур.

Аналогічно поглинання зворотний перехід електронів на нижній електронний рівень також призводить до коливально збудженого стану. Термічне рівновагу досягається за час 10 -12 с. Цікавим наслідком такого розгляду є те, що спектр поглинання молекули відображає коливальну структуру збуджених електронних станів, а спектр випромінювання — коливальну структуру основного електронного стану. У більшості випадків електронне збудження не сильно змінює розташування коливальних рівнів енергії. Внаслідок цього коливальні структури, які у спектрах поглинання і випромінювання, подібні.

Молекули в стані S1 можуть також піддаватися конверсії в перший триплетний стан Т1. Випускання з Т1 зване фосфоресценцією, зазвичай зрушено у бік більших довжин хвиль (менших енергій) проти флуоресценцією. Конверсія S1 в Т1 називається інтеркомбінаційною конверсією. Перехід з Т1 в основний стан заборонений, внаслідок чого константа швидкості такого випромінювання на кілька порядків менша за відповідну константу для флуоресценції.

На випромінювання флуоресценції можуть впливати й інші фактори, не показані в явному діаграмі Яблонського: вплив розчинників, релаксація розчинника, гасіння, а також реакції, що відбуваються в збуджених станах.

4. Висновок

Люмінесценція- один із видів випромінювання речовини, надлишкового над тепловим випромінюванням тіла при даній температурі. Випромінювання спостерігається внаслідок переходу електронно-збуджених атомів, молекул, радикалів, іонів — про центрів люмінесценції, в основний стан. За тривалістю процесу випромінювання розрізняють короткочасну люмінесценцію, яка називається флуоресценцією і повільну люмінесценцію, яка називається фосфоресценцією.

У 1852 році Джордж Стокс встановив, що довжина хвилі фотолюмінесценції більша за довжину хвилі збудливого світла (правило Стокса). В 1864 їм запропоновано використання явища люмінесценції для якісного аналізу органічних речовин. Широке застосування люмінесцентних методів аналізу отримали в 30-ті роки XX століття завдяки роботам Вавілова та його школи.

Процес люмінесценції може відбуватися у різних речовинах, що у різних агрегатних станах. Особливості випромінювання різних люмінесцентних центрів можна використовувати в аналітичних цілях.

Для збудження люмінесцентного центру можна використовувати різні джерела. Необхідною умовою їхньої ефективності є величина енергії випромінювання, яка має бути достатньою для збудження електронного переходу у досліджуваній речовині. Різні види люмінесценції знаходять застосування у різних варіантах методу люмінесцентного аналізу.

Найбільш універсальний метод збудження люмінесценції – фотозбудження досліджуваної речовини. Він найчастіше використовується як в атомних, так і в молекулярних методах аналізу. При фотозбудженні легко регулювати довжину хвилі збуджуючого випромінювання, його інтенсивність та поляризацію. При аналізі багатокомпонентної суміші можна порушити електронний перехід, що супроводжується люмінесценцією тільки в одного з компонентів суміші. Таким чином, стає можливим проводити вибірковий (селективний) аналіз суміші речовин.

Найбільш широке застосування у аналітичних цілях має молекулярна фотолюмінесценція для речовин, що у розчині.

5. Список літератури

А.А. Іщенко, М.А. Гольдштрах ЛЮМІНЕСЦЕНТНИЙ АНАЛІЗ. Навчальний посібник. М.: МІТХТ ім. М.В.Ломоносова, 2009 - 36 с. мул.
Основи аналітичної хімії. У 2 кн. Кн. 2. Методи хімічного аналізу: Навч. для вузів/Ю. А. Золотов, Є. М. Дорохова, В. І. Фадєєва та ін / За ред. Ю. А. Золотова. - 3-тє вид., Перероб. і доп.- М.: Вищ. шк., 2004. - 503 с: іл. - (Серія «Класичний університетський підручник»).
Столяров К. П., Григор'єв Н. Н. Введення в люмінесцентний аналіз неорганічних речовин. - Л., 1967. - 364 с.
Фотобіофізика. Версія 1.0 [Електронний ресурс]: електрон. навч. посібник / І. Е. Суковата, В. А. Кратасюк, В. В. Межевікін та ін - Електрон. дано. (9 Мб). - Красноярськ: ІПК СФУ, 2008.

Вибачте, нічого не знайдено.