РНГ іфа. Серологічна діагностика інфекційних хвороб

Сутність серологічних методівдослідженняполягає у визначенні титру антитіл у сироватці крові хворого в динаміці хвороби стосовно відомого антигену, що вводиться в серологічну реакцію.

У клінічній практицінайчастіше використовується реакція аглютинації (РА) Відаля, її різновиди, РНГА, РСК та більш інформативні сучасні методи (ІФА, РІА, ЛІФА та ін.).

РА- визначення невідомих антитіл за допомогою відомих антигенів та встановлення виду збудника за допомогою відомих антитіл. РІГА та РНДА- Найбільш специфічні, використовуються мічені еритроцити. РТГА- ґрунтується на здатності деяких вірусів аглютинувати еритроцити. РІ- реакція імунодифузії, різна здатність антигенів та антитіл дифундувати у гелі. РСКтитрування антигенів або антитіл за ступенем фіксації комплементу з комплексом антиген-антитіло. PH- здатність антитіл нейтралізувати токсини та антигени вірусів. ІФА- використовуються антитіла, кон'юговані з ферментом. РІА- використовується радіоактивна мітка антигенів або антитіл. ЛІФА- лантанідний імунофлюоресцентний аналіз - використовуються як мітки елементи рідкісноземельних металів.

Забір крові для серологічного дослідженнявиконується так само, як і при сівбі, але на відміну від останнього, його краще здійснювати самопливом, а не шприцем. Для цього беруть голку з ширшим просвітом і вводять у ліктьову вену без шприца. У пробірку збирають 3-5 мл крові. За такого збору еритроцити менше травмуються і сироватка крові рідше буває з явищами гемолізу. Після відстоювання та центрифугування крові сироватку за допомогою піпетки переносять в іншу пробірку або епіндорф і зберігають у холодильнику при температурі +4 °С до постановки реакції. Оскільки імунна відповідь при більшості інфекційних хвороб розвивається з 5-7-го дня, а максимальне наростання титру антитіл відбувається лише в періоді реконвалесценції, серологічні методи менш придатні для ранньої діагностики та використовуються головним чином для ретроспективного розшифрування етіології вже перенесеного інфекційного захворювання.

Однак кров для серологічних досліджень береться і в перші дні хворобищо надалі дає можливість спостерігати за наростанням титру антитіл у динаміці захворювання. Повторні серологічні дослідження при бактеріальних інфекціях проводять не раніше, ніж через 5-7 днів. При вірусних захворюваннях беруться «парні сироватки»з інтервалом 10-12 днів та при наростанні титру антитіл у 4 рази і більше підтверджується діагноз передбачуваного захворювання.

Структура відповіді Методи серологічної діагностики, сутність. Правила забору крові. Трактування результатів. Парні сироватки.

Нові статті:

Патогенетична терапія інфекційних хворих - Види патогенетичної терапії, групи препаратів, приклади захворювань - 17/08/2012 07:55

Серологічне дослідження, або, іншими словами - серологічний аналізЦе дослідження біологічних матеріалів в лабораторії. Цей аналіз дозволяє встановити наявність хвороботворних бактерій у досліджуваному організмі, або – у продуктах, що проходять контрольну перевірку.

Серологічні методи діагностики

Дослідження сироваток або інших біологічних об'єктів (молоку, жовчі, слини, змивів слизової оболонки кишечника, а також - копроматеріалів) дає досить достовірне уявлення про відповідь організму на впровадження інфекційного агента. Слід зазначити, що застосування серологічних методів дослідження має не лише діагностичне значення, але дає достовірні відомості про рівень захисту організму, стан популяційного імунітету, циркуляцію різних типів в обстежуваному регіоні. Результати серологічних обстежень можуть також надати інформацію для оптимізації антигенного складу профілактичних препаратів та використовуватися з метою оцінки імунологічної ефективності вакцин.

Однак слід зазначити, що необхідність дослідження парних сироваток крові, що забираються з інтервалами 1,5-2 тижні, та наявність експресних методів діагностики знижують діагностичну цінність серологічних реакцій.

Тому традиційні серологічні тести - реакції зв'язування комплементу (РСК) та реакція гальмування гемаглютинації (РТГА), знаходять нині лише обмежене застосування. Проте простота цих методів, доступність і дешевизна реагентів роблять їх застосовними в лабораторній практиці. Постановка РСК та РТГА здійснюється за загальноприйнятими методиками.

Прикладом використання РЗК для вивчення поствакцинального імунітету є робота К. Мідхана (1989 р.). При обстеженні сироваток від 116 дітей у віці 5 місяців достовірні сероконверсії, за даними РЗК, були відзначені в 44% випадків, а за результатами реакції нейтралізації (PH) та імуноферментного аналізу (ІФА) - у 83 і 96% відповідно.

Дослідження імунітету

З метою вивчення популяційного імунітету за допомогою РЗК нами було обстежено 1246 сироваток хворих на ОКЗ у віці від кількох місяців до 80 років і старше. Показано, що середньогеометричні титри комплементзв'язуючих антитіл були найбільш високими у вікових групах 2 - 4 та старше 60 років, що підтверджує отримані нами раніше дані про найбільшого поширенняротавірусної інфекції серед осіб зазначених вікових груп

Аналіз на ротавірус

РТГА використовується у вивченні ротавірусної інфекції частіше, ніж РЗК, і, як правило, у поєднанні з іншими лабораторними тестами. Так, Andrade J. Р. та ін. застосували РТГА, імуно-блот, блок ІФА для вивчення антитіл до структурних білків ротавірусу VP2, VP4, VP6 та VP7. За даними авторів, у дітей від 2 до 4 років виявили антигемагглютинуючі антитіла до ротавірусів у 70-80%.

Залежно від рівня антитіл до певних білків, за даними РТГА, автори виділили 4 групи осіб. До I та II групи (60%) увійшли діти з високим рівнемантитіл до VP4 та VP7 та були класифіковані як «імунні». У ІІІ групу (4%) віднесені особи з низьким рівнемантитіл до VP7 та VP6, так звані «частково імунні». Діти IV групи (36%), у яких, за даними РТГА, антитіла не були виявлені, позначені як «неімунні» та склали групу ризику, тому що серед них можливий розвиток вираженої ротавірусної інфекції. Слід зазначити, що у цьому спостереженні показники чутливості РТГА та блок ІФА були цілком порівнянними.

РТГА неодноразово використовували вивчення структурного білка VP4. Дослідження показали, що його гемаглютинуюча активність специфічно інгібується антисироваткою, тим самим підтверджуючи, що VP4 є гемаглютиніном ротавірусів. Аналогічні дані були опубліковані раніше М. Єзекієлем (1995).

Таким чином, представлені роботи показують, що РЗК та РТГА все ще застосовують при вивченні ротавірусної інфекції, проте ці методи мають допоміжний характер і повинні дублюватися іншими тестами.

Нейтралізаційні тести

Реакція нейтралізації заснована на здатності імунних сироваток людини або тварин нейтралізувати репродукцію вірусу і тим самим запобігти пов'язаним із цим феноменом проявам. Залежно від біологічної моделі цими проявами можуть бути: розвиток захворювання зі специфічною клінікою, репродукція та виділення вірусу, вироблення специфічних антитіл, а також поява цитопатичного ефекту або утворення пляк при використанні культури клітин.

Макробіологічні моделі в даний час застосовуються переважно у ветеринарії, виявлення вірусів у людей у більшості випадків проводиться на культурі клітин, як первинних, так і переливаються. Методи PH поділяються на дві групи за принциповою схемою постановки. В одній групі методів нерозведена сироватка поєднується із серійними розведеннями вірусу, в іншій – розведення сироватки випробовуються із постійною дозою вірусу. Для постановки реакції нейтралізації переважним є збудник, що викликає виражений цитопатичний ефект або інтенсивно репродукується в біологічній моделі.

Однак ротавіруси, на жаль, мають слабо виражений цитопатичний ефект, що переконливо продемонстрували дослідники під керівництвом Б. Вебера (1992 р.). Дослідження 121 проби калу хворих на ОКЗ дітей з використанням класичного методу виділення вірусу на клітинах МА-104 під контролем ЦПД виявило лише 4 позитивні випадки (3,3%), тоді як застосування сучасних методіввиявлення ротавірусів (ІФА, ПЛР, ЕФ у ПААГ) дозволило підвищити цей показник до 54,4%. Отже, для підвищення чутливості PH потрібні додаткові методичні прийоми, що сприяють візуалізації редукції вірусу, в якості яких використовуються: радіоактивна або імунофлюоресцентна мітка, плякобразование, иммунопероксидазна забарвлення і т. д. При цьому слід відзначити, що сам принцип визначення рівня віруснейтра класичному методу PH, відрізняючись від нього лише способом вирішення, тобто візуалізацією віруснейтралізуючої активності сироватки. У цьому випадку активність сироватки визначають за її здатністю пригнічувати прояви інфекційних властивостей вірусу.

В даний час у більшості досліджень використовуються два методи вимірювання кількості віруснейтралізуючих антитіл до ротавірусу. Один із них заснований на підрахунку числа індивідуальних вірусінфікованих клітин (метод пляк), що специфічно зв'язуються з антитілами, кон'югованими флюоресцентом. В іншому тесті про рівень нейтралізації вірусу судять щодо зниження продукції вірусного антигену ім-муноферментним методом. Порівняльне вивчення обох методів показало лінійну залежність між показниками ІФА та числом пляк-формуючих одиниць для кожного прототипного штаму серотипу ротавіруса: Wa, DS-1, Р, VA-70. Отримані дані дозволяють легко визначити розведення сироватки, що забезпечує нейтралізацію 60% інфекційного вірусу (титр антитіл, що нейтралізує). Виявилося, що титри антитіл при тестуванні матеріалів обома методами однакові і обидва тести не різняться по відтворюваності результатів. Деяка перевага методу з використанням антитіл, мічених флюоресцеїном, на думку авторів, полягає у більшій об'єктивності обліку результатів (автоматизована реєстрація) та у меншій трудомісткості.

Для вимірювання титрів віруснейтралізуючих антитіл використовують модифіковану PH за допомогою блокування ІФА за допомогою моноклональних антитіл.

вивченню інтенсивності вироблення віруснейтралізуючих антитіл (ВНА) при природній інфекції та вакцинації;
освіту ВНА до різних структурних білків ротавірусів;
оцінки ролі ВНА сироваток крові та секреторних антитіл слини та слизової оболонки кишечнику в захисті від природної інфекції (Ward R. et al., 1990, 1992, 1993, 1995, 1997).

На закінчення необхідно підкреслити, що реакція нейтралізації в різних її модифікаціях дотепер широко використовується як в експериментальних, так і клінічних дослідженнях і, володіючи високою чутливістю та специфічністю, є еталоном для інших серологічних методів.

Преципітаційний аналіз

Преципітаційні тести ґрунтуються на взаємодії сироватки з вірусними антигенами за допомогою осмотичних процесів або під впливом електричного поляу гелевому середовищі чи іншого виду носія. Одним з таких методів є реакція зустрічного імуноелектрофорезу (ВІЕФ). Автори досліджували сироватки крові здорових та хворих на ротавірусну діарею дорослих та дітей, а також препарати специфічного імуноглобуліну на наявність антитіл до людського ротавірусу методом ВІЕФ у 7% агарозі з додаванням 4% поліетиленгліколю. Виявилося, що антитіла до RV циркулювали досить широко та виявлені у хворих дорослих та дітей у 90,2-87,7% відповідно, а також у 78,4% здорових дітей віком до 1 року. Усі 32 серії імуноглобуліну містили антитіла до РВ у титрах 1:4-1:128. На думку авторів, метод придатний вивчення популяційного імунітету.

Радіоімунопреципітація

Інший преципітаційною методикою є радіоімунопреципітація. Автори використовували цей метод для вивчення імунної відповіді до структурних та неструктурних білків при первинній ротавірусній інфекції та показали, що імунна відповідь була більш виражена до VP4, ніж до VP7.

При вивченні сироваткової та секреторної імунологічної відповіді на застосування тетравалентної реассортантної вакцини у новонароджених Для цього була використана радіоімунологічна техніка дослідження поряд з ІФА та PH. При цьому було показано, що імунна відповідь у сироватці залежить від дози антигену, що вводиться; Що ж до виявлення антитіл у слині, то автори пояснюють їхню появу із споживанням грудного молока.

Реакція радіоімунопреципітації використовується і в тонких науково-дослідних роботах. Так, Дж. Тоссер використав цей метод для вивчення топології білка VP6 у структурі геному і висловили припущення, що VP 6 бере участь у освіті каналів внутрішнього капсиду.

Інші дослідники у 1994 році також використовували метод радіоімуннопреципітації для вивчення імунологічних зрушень при ротавірусній інфекції. Автори показали, що в гострому періоді реєструються, головним чином, IgA до VP2 і VP6, тоді як у період реконвалесценції знижувалася інтенсивність вироблення секреторних антитіл (IgA) не тільки до VP2, але й до інших структурних та неструктурних білків. Пізніше аналогічні дані були отримані із застосуванням радіоімунопреципітаційного методу. Автори показали, що в імунологічному процесі, крім VP4 та VP7, беруть участь також VP2, VP6 та NSP2.

Таким чином, імунопреципітація використовувалася з діагностичною метою для вивчення імунної відповіді при природній ротавірусній інфекції.

У Останніми рокамиімунопреципітацію замінив метод радіоімунопреципітації, який застосовується для оцінки поствакцинального та постінфекційного імунітету при RV інфекції та для тонких науково-дослідних розробок.

Гібридизаційні методи

Для визначення антитіл до ротавірус широко застосовують метод імуноблоту. Прикладом використання Western-blot у діагностиці ротавірусної інфекції служить робота Х. Ушижими (1989 р.), який, за допомогою імуноблотингу, охарактеризував специфічність антитіл до структурних білків RV у 21 дитини з ОКЗ, а також рівень копроантитіл класів IgA та IgG у неінфікованих дітей. Автори висловили припущення, що імуно-блотинг може дозволити встановити діагноз захворювання на одну пробу копроантитіл без дослідження парних сироваток крові. Можливість застосування Western-blot для визначення рівня антитіл до VP1, VP2, VP4, VP6 та VP7 була продемонстрована Павловим І. та ін. (1991). Автори досліджували сироватки крові людей і тварин на наявність антитіл до штамів ротавірусів SA-11, DS-1, Wan Ito і дійшли висновку, що Western-blot може бути успішно використаний для оцінки імунітету в клінічній практиці.

Вважають, що імуноблот може бути використаний для підтвердження діагнозу ротавірусної інфекції без використання парних сироваток по одній пробі копроантитіл.

Поряд з РТГА та ІФА, імуноблот використовували для вивчення популяційного імунітету. Виявлено групу осіб, неімунних по відношенню до VP2, VP4, VP6 та VP7, які представляють групу ризику, що насамперед потребує захисту засобами активної та пасивної імунізації (Andrade J. Р. et al., 1996).

Застосування імуноблоту у вивченні серологічних зрушень у процесі природної інфекції RV відзначають і Begue R. et al. (1998). Автори підтвердили, що в імунній відповіді на інфікування найчастіше беруть участь антитіла до VP2 і VP6, менш часто - до VP7 і VP4.

Імунофлюоресцентний аналіз

Імунофлюоресцентний метод у непрямому варіанті з використанням антивидових сироваток, мічених флюорохромом, застосовується для титрування випробуваних сироваток на клітинах, заражених ротавірусами. В основі реакції лежить специфічна взаємодія мічених антитіл та гомологічного антигену, при цьому комплекс антиген-антитіло легко виявляють за допомогою люмінесцентного мікроскопа.

Використовуючи цей метод, автори провели серологічне обстеження двох груп південноамериканських індіанців та виявили високий відсоток серопозитивних осіб в обох групах: 67,8 та 77,4% за даними ІФА та 45,5 та 56,7% за результатами ІФМ відповідно.

В іншому дослідженні, присвяченому визначенню рівня антитіл до RV групи С у пуповинній крові за допомогою ІФМ, було показано, що у 30% жінок дітородного віку виявлялися ці антитіла, що свідчать про перенесену інфекцію.

Імуноферментний аналіз використовується в даний час поряд з PH у серологічній діагностиці ротавірусної інфекції надзвичайно широко. Цей метод, заснований на використанні антитіл або антигену, мічених ферментом, завдяки простоті виконання та економічності найбільш прийнятний та перспективний для серологічної діагностики ротавірусної інфекції. Метод дозволяє проводити масові сероепідемічні обстеження населення, оцінювати імунологічну та епідеміологічну ефективність вакцин, вивчати захисну роль антитіл різних класів у різних біологічних рідинах людського організму, а також здійснювати серологічну діагностику ротавірусної інфекції.

Численні дослідження за допомогою ІФА були проведені Р. Азередо (1989 р.), які показали, що кількість хворих на ОКЗ встановленої ротавірусної етіології була значно нижчою за рівень їх інфікованості за результатами серологічного обстеження. Ці дані виявили, що багато клінічні випадкиротавірусні інфекції не діагностуються методом виявлення RV у фекаліях. Подальші дослідження щодо вивчення поширеності ротавірусної інфекції підтвердили це припущення. При проведенні сероепідеміологічних обстежень було виявлено, що 50-70% населення мали високий рівень антитіл, що свідчить про широку циркуляцію RV в людській популяції.

Ще більші можливості відкриває ІФА щодо динаміки рівня антитіл, що належать до різних класів імуноглобулінів. Так, за даними автори методики у 1989 році стверджують, що в процесі вакцинації достовірний приріст антитіл до RV у крові відзначався у 83-96%. Антиротавірусні антитіла класів IgA та IgG однаково добре виявляли ІФА та PH за редукцією пляк – 67,6 та 70,0% відповідно. Сероконверсія антитіл класу IgM була виявлена у 53 та 44% дітей методами ІФА та РСК відповідно. За результатами аналізу інтенсивності вироблення антитіл різних класів автори зробили висновок, що найбільш ефективним, простим та швидким методом виявлення сероконверсій після вакцинації є спосіб виявлення антитіл IgA за допомогою ІФА.

Цей висновок знайшов своє підтвердження і в роботі Р. Бішопа (1996), в якій зазначено, що за результатами обстеження 68 пар мати-дітя з діагностованою RV інфекцією показано, що виявлення антитіл класу IgA за допомогою ІФА в копроматеріалах є найбільш чутливим маркером як клінічно вираженої, і безсимптомної інфекції. Аналогічні результати при обстеженні дітей із вираженою RV діареєю було отримано Дж. Коломіною 1998 року.

Проте вивчення інтенсивності сероконверсій необхідне дослідження парних сироваток, що значно подовжує процес діагностики. У той самий час загальновідомо, що поява антитіл класу IgM є свідченням початку інфекційного процесу. За нашими даними, отриманими при обстеженні хворих на ротавірусну інфекцію методами ІФА та РЗК, виявилося, що, за результатами ІФА, всі обстежені особи містили в крові IgM антитіладо RV, тоді як за даними РСК - лише 77% (Р

В останні роки з реалізацією можливості визначення гено- та серотипоспецифічних антитіл ІФА став воістину універсальним методом вивчення ротавірусної інфекції, який використовується:

при вивченні вироблення антитіл класів IgA, М, G до окремих структурних та неструктурних білків RV;
в оцінці імунологічної ефективності різних видіввакцин: атенуйованих, холодоадаптованих, ДНК-ових, реассортантних;
при вивченні вироблення антитіл у різних біологічних рідинах організму в умовах природної інфекції та при імунізації.

Таким чином, як випливає з представлених даних, та імунологічні аспекти ротавірусної інфекції вивчають за допомогою широкого спектру лабораторних методів. Внаслідок цього вибір оптимального методу дослідження з урахуванням його роздільної здатності, економічних та часових витрат досить складний і залежить від завдань, що стоять перед дослідниками, а також оснащеності лабораторії. І все ж таки з різноманіття методів, на наш погляд, слід виділити два - реакцію нейтралізації на культурі клітин і імуноферментний аналіз, - Забезпечують вивчення антитіл до різних класів імуноглобулінів. Особливу перспективність цих методів для використання у широкій практиці визначає реалізована можливість експрес-діагностики ротавірусної інфекції.